了解你的样品吗？
在日常色谱分析中，大家都会碰到需要自己来建立一个色谱方法或者对现有的方法进行调整的情况。充分了解待分析的样品，是建立一个HPLC方法的基本前提，对样品越了解，则越能收到事半功倍的效果。
在建立一个色谱方法之前，我们首先必须根据得到的样品信息进行预判，采用哪种色谱模式最有希望得到理想的效果——HPLC ，GC，CE还是SFC? 如果确定采用HPLC的方法，下一步则将有关样品具体分类，属于一般小分子化合物样品，还是其他特殊样品。特殊样品包括如无机离子，异构体，小分子生物样品（肽，糖，核苷酸），大分子生物样品（蛋白质，核酸，多聚糖）以及合成聚合物等。
对于一般小分子化合物样品，则首先需要了解的信息有：
- 样品大概有多少个组分；
- 实验的目标组分有哪些（一定要明确）；
- 目标组分含量大概多少；
- 干扰物质检测的物质有哪些（尽可能了解，便于复杂样品的前处理）；
明确了实验的目标组分，则需要进一步了解目标组分的详细信息，包括：
- 化学结构，特征官能团
- 化合物的溶解性（logP值）
- 化合物的酸碱性（pKa值）
- 化合物的检测方式
- 化合物的稳定性
对于目标组分，我们首先了解化合物的化学结构，如果是未知化合物，则需了解大致有哪些特征的官能团，如羟基，氨基，苯环，羧基，含氮杂环等，最终的目的都是了解化合物的极性大小（logP值）和化合物的酸碱性（pKa值）。而化合物的这两个参数往往决定了在液相色谱方法开发中固定相和流动相的类型。
logP值
logP值也就是logPow值，指某物质在正辛醇（油）和水中的分配系数比值的对数值。反映了物质在油水两相中的分配情况。logP值越大，说明该物质越亲油，非极性越强；反之，越小，则越亲水，即水溶性越好，极性越强。
当化合物属于典型的非极性化合物(logP>1)时，通常选择反相如C18，C8，苯基之类的固定相；
当化合物属于典型的大极性化合物(logP<0)时，可以选择具有极性修饰的反相柱，正相色谱柱，Hilic柱，混合模式的色谱柱；离子型的化合物还能选择离子交换色谱柱，混合模式的色谱柱或者采用添加离子对试剂的方式等。
当化合物处于非极性化合物与大极性化合物之间时，上述多种分析模式都可以选择。
LogP值能大致确定分析色谱柱固定相的类型，具体的通常还需根据目标化合物之间的结构差异来决定选择哪种固定相。
除此之外，通过化合物的logP值也能大致确定在液相色谱方法中流动相洗脱的强弱，以及样品溶剂的选择。
pKa值
解离常数pKa是水溶液中具有一定解离度的溶质的极性参数。解离常数给予分子的酸性或碱性以定量的量度，Ka增大，对于质子给予体来说，其酸性增加；Ka减小，对于质子接受体来说，其碱性增加。
对于pKa值的认识有一个误区，大家经常会将pKa值与pH值混淆，将pKa值为7作为酸碱化合物的分界线，认为pKa<7为酸，pKa>7则为碱。其实这是一个错误的认识。例如，苯酚的pKa值为10.0，但其实际为酸性物质。
对于酸碱目前最广泛的定义是凡是能给出质子的物质都是酸，凡是能接受质子的都是碱。酸碱共轭关系：酸=碱+质子（酸越强，其共轭碱就越弱）
弱碱性物质，pH=pKa+lg[B]/[BH+]
弱酸性物质，pH=pKa+lg[A-]/[HA]
分析化合物的pKa值往往决定着流动相的选择。为了保证分析物物在色谱柱上的保留和峰形，流动相pH值应该尽可能使得目标分析物在流动相中成中性分子的状态。因此，作为一般规则，流动相的pH值应该选择在分析物pKa值上±2pH单位。
下表是一些常见官能团的pKa值
掌握了以上样品的信息，我们初步的固定相和流动相基本确定完成，剩下的就是确定检测方式，检测器的选择主要是根据物质的结构特征和实验室仪器配置条件来决定。
此外，还需要了解样品的稳定性。这也非常关键，能够在关键时刻排除在方法开发过程中遇到的一些问题，如鬼峰产生，峰面积减小，保留时间不固定等等。
